Construido por Antonio Sillero y posteriormente por Juan Bautista de Toledo entre 1559 y 1564 como monasterio de las Clarisas, ocupa el antiguo palacio donde residieron Carlos I e Isabel de Portugal y donde nació, en 1535, su hija doña Juana, posterior fundadora del convento. Ella misma está sepultada en una capilla, con escultura funeraria orante realizada por Pompeyo Leoni.

En cuanto a su arquitectura, la fachada, de estilo plateresco, y la magnífica escalera renacentista, son los elementos originales más interesantes. El interior se reformó completamente en el siglo XVIII por Diego de Villanueva. En la clausura se conserva la estructura y muchos elementos decorativos del palacio plateresco.

En este monasterio, gestionado actualmente por Patrimonio Nacional, vivieron doña Juana y luego su hermana María, emperatriz viuda, que falleció aquí en 1603. Del siglo XVII se conservan pinturas al fresco en la escalera y en la Capilla del Milagro. Destacan los tapices tejidos en Bruselas sobre cartones de Rubens representando la Apoteosis de la Eucaristía, encargados para este monasterio por la hija de Felipe II, la Infanta Isabel Clara Eugenia, Gobernadora de los Países Bajos.

El Monasterio ha sido catalogado como Bien de Interés Cultural, obteniendo además la distinción de Museo Europeo del año 1987. Su última reforma, emprendida durante el cierre forzoso por la pandemia en 2020 y 2021, ha permitido llevar a cabo una gran renovación museográfica que ha afectado a ocho de sus salas, incluyendo la restauración de más de 50 obras, la incorporación de piezas procedentes de la clausura y la instalación de un nuevo sistema de iluminación con tecnología led.