Construído por Antonio Sillero e depois por Juan Bautista de Toledo entre 1559 e 1564 como mosteiro das Clarissas, ocupa o antigo palácio, residência de Carlos I e Isabel de Portugal e onde, em 1535, nasceu a sua filha D. Juana, futura fundadora do convento. Ela própria está sepultada numa capela com escultura funerária em prece de Pompeyo Leoni.

Quanto à arquitetura, a fachada, de estilo plateresco, e a magnífica escada renascentista, são os elementos originais mais interessantes. O interior foi remodelado completamente no século XVIII por Diego de Villanueva. A clausura ainda conserva a estrutura e muitos elementos decorativos do palácio plateresco.

Neste mosteiro viveram D. Juana e depois a sua irmã María, imperatriz viúva, que aqui faleceu em 1603. Do século XVII conservam-se os frescos da escadaria e da Capela do Milagre. Destacam-se os tapetes tecidos em Bruxelas, a partir de modelos de Rubens que representam a Apoteose da Eucaristia, encomendados para este mosteiro pela filha de Felipe II, a Infanta Isabel Clara Eugenia, Governadora dos Países Baixos.

O mosteiro, catalogado como Bem de Interesse Cultural, foi distinguido como Museu Europeu do Ano em 1987. A última reforma, empreendida durante o encerramento forçado devido à pandemia em 2020 e em 2021, permitiu levar a cabo uma grande renovação museográfica, abrangendo oito das suas salas, incluindo o restauro de mais de 50 obras, a incorporação de obras procedentes da clausura e a instalação de um novo sistema de iluminação com tecnologia LED.