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Este pequeño templo está construido sobre el solar en el que, según la tradición, estuvo la casa donde vivieron San Isidro y su esposa, Santa María de la Cabeza, situado en el barrio de La Latina. Después de su muerte, el cuerpo de San Isidro estuvo custodiado en la parroquia de San Andrés hasta que, en 1518, el Papa León X concedió su custodia a la familia Vargas, quienes posteriormente lo depositaron en la Capilla del Obispo, contigua a la mencionada parroquia.

Las obras de la capilla empezaron el 12 de abril de 1657, siendo solemnemente inaugurada el 15 de mayo de 1699 en presencia de los reyes Felipe IV y su esposa Mariana de Austria. El edificio constituye un magnífico ejemplo de construcción barroca. Desechado un primer proyecto de Juan Gómez de Mora en 1629, las obras se iniciaron siguiendo las trazas de Pedro de la Torre.

Adosada a la parroquia de San Andrés, la Capilla de San Isidro tiene entidad propia; se construyó sobre una planta alargada (perpendicular a la parroquia), y cuenta con una cúpula encamomada rematada con una linterna. A Pedro de la Torre le siguieron en la construcción José de Villarreal, en 1657, y, más tarde, Juan de Lobera, quien remató las obras en 1669.

El cuerpo del santo se continuó venerando en la Capilla de San Isidro hasta que, en 1769, tras la expulsión de la Compañía de Jesús, se procedió al traslado de los restos a la iglesia del Colegio Imperial, en la calle Toledo, desde entonces conocida como Colegiata de San Isidro.

El 18 de julio de 1936, a las pocas horas de iniciarse la Guerra Civil, capilla y parroquia fueron incendiadas, quedando totalmente destruidas, lo que motivó que, después de la guerra, el edificio fuera totalmente reconstruido, prolongándose su restauración hasta 1991.