Costruito, tra il 1559 e il 1564, da Antonio Sillero e poi da Juan Bautista de Toledo come monastero delle clarisse, occupa il luogo dell’antico palazzo in cui vissero Carlo I e Isabella d’Aviz e in cui nacque, nel 1535, loro figlia Giovanna, posteriore fondatrice del convento. Lei stessa riposa qui, sepolta in una cappella, con scultura funebre orante realizzata da Pompeo Leoni.

Quanto alla sua architettura, la facciata in stile plateresco e la magnifica scalinata rinascimentale sono gli elementi originali più interessanti. L’interno fu completamente ristrutturato nel XVIII secolo da Diego de Villanueva. Nella parte di clausura si conservano la struttura e molti elementi decorativi del palazzo plateresco.

In questo monastero vissero Giovanna d’Asburgo e poi la sorella Maria, imperatrice vedova, che vi morì nel 1603. Del secolo XVII rimangono gli affreschi nella scalinata e nella Capilla del Milagro. Meritano una menzione speciale gli arazzi tessuti a Bruxelles su cartoni di Rubens, in cui è raffigurata l’Apoteosi dell’Eucaristia, commissionati per questo monastero dall’Infanta Isabella Clara Eugenia, Governatrice dei Paesi Bassi e figlia di Filippo II.

Il Monastero è stato dichiarato Bene di Interesse Culturale e ha ricevuto anche la distinzione di Museo Europeo nel 1987. La sua ultima ristrutturazione, intrapresa durante la chiusura forzata a causa della pandemia nel 2020 e 2021, ha permesso un’importante riorganizzazione museale che ha interessato otto delle sue sale, tra cui il restauro di oltre 50 opere, l'inclusione di pezzi provenienti dal chiostro e l'installazione di un nuovo sistema di illuminazione con tecnologia LED.