Édifié par Antonio Sillero et ensuite par Juan Bautista de Toledo entre 1559 et 1564 comme monastère des Clarisses, il occupe un ancien palais où résidèrent Carlos I^er et Isabelle du Portugal et où naquit en 1535 leur fille Jeanne, future fondatrice du couvent. Cette dernière est enterrée dans la chapelle, avec un gisant la représentant en prière réalisé par Pompeyo Leoni.

En ce qui concerne l'architecture, sa façade de style plateresque et son magnifique escalier de la Renaissance sont les éléments originaux les plus intéressants. L'intérieur a été totalement rénové au XVIIIe siècle par Diego de Villanueva. Le cloître conserve la structure et de nombreux éléments décoratifs du palais plateresque.

Ce monastère fut habité par doña Juana et ensuite par sa sœur Marie, impératrice douairière, qui y décéda en 1603. Du XVIIe siècle datent des peintures à fresque présentes sur l'escalier et dans la Capilla del Milagro (chapelle du Miracle). Les principales œuvres qu'elle renferme sont des tapisseries tissées à Bruxelles, à partir de cartons de Rubens représentant le Triomphe de l'Eucharistie, commandés pour ce monastère par la fille de Philippe II, l'infante Isabelle Claire Eugénie, gouvernante des Pays-Bas.

Le monastère a été déclaré Bien d’Intérêt Culturel et a obtenu la distinction de musée européen de l’année 1987. Sa dernière rénovation en date, entreprise pendant la fermeture forcée suite à la crise du Covid-19 en 2020 et 2021, a permis notamment le réaménagement de huit salles abritant quelque 200 œuvres, avec la restauration d'une cinquantaine d'entre elles, l'inclusion de nouvelles pièces et l'installation d'un nouveau système d'illumination LED.