Das zwischen 1559 und 1564 zunächst von Antonio Sillero und später von Juan Bautista de Toledo als Klarissenkloster erbaute Gebäude nimmt den alten Palast von Karl I. und Isabel von Portugal ein. 1535 wurde hier ihre Tochter Juana geboren, die später das Kloster gründete. Ihre Überreste sind in einer Kapelle begraben mit einer Grabskulptur von Pompeyo Leoni.

Die architektonisch interessantesten Elemente sind die Gebäudefassade in platereskem Stil und die imposante Renaissance-Treppe. Im 18. Jahrhundert wurde es von innen komplett durch Diego de Villanueva renoviert. In der Klausur sind noch zahlreiche strukturelle und Dekoelemente des plateresken Palastes erhalten.

In diesem Kloster lebten sowohl Juana als auch ihre Schwester Maria, des Kaisers Witwe, die hier 1603 verstarb. An der Treppe und in der Capilla del Milagro sind gut erhaltene Fresken aus dem 17. Jahrhundert zu sehen. Sehenswert sind auch die in Brüssel gewebten Wandteppiche, die an Rubens Apotheose der Eucaristia angelehnt sind, und von der Tochter von Phillip II., der Prinzessin Isabella Clara Eugenia – Statthalterin der Niederlande – für dieses Kloster in Auftrag gegeben worden sind.

Das Kloster wurde als bedeutendes Kulturgut eingestuft und 1987 als Europäisches Museum des Jahres ausgezeichnet. Seine letzte Renovierung, die während der pandemiebedingten Zwangsschließung 2020 und 2021 stattfand, ermöglichte eine umfassende Modernisierung von acht Räumen des Museums mit Restaurierung von über 50 Werken, die Aufnahme von Stücken aus dem Klausurbereich sowie die Installation eines neuen LED-Beleuchtungssystems.